一、疾病名称

亨廷顿病（Huntington’s disease，HD）

二、HD简介

临床症状主要表现为舞蹈样不自主动作、精神障碍和进行性痴呆，称为“三联征”。

病理表现主要为基底节区萎缩，其中以尾状核最为明显，壳核和苍白球也有不同程度的萎缩。神经元缺失主要见于基底节区和皮质。

发病机制是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病。患者第四号染色体上的Huntington基因发生变异，产生了变异的mHTT，在细胞内逐渐聚集，形成大的分子团，在脑中积聚，影响神经细胞的功能。

三、亨廷顿蛋白与HD

huntington基因处在第4号染色体的上部，亨廷顿病是由于huntington基因第1外显子内部不稳定的CAG三核苷酸重复序列异常扩展而发病，属于三联体重复序列疾病。等位基因CAG的重复数在正常人多在26次以下，HD患者则多超过40.5次，平均46.42次，可高达100次。

huntington蛋白在全身各个器官包括中枢神经系统广泛表达，其正常功能尚未完全明确，可能与神经系统发育、细胞内吞和分泌及抑制细胞凋亡有关。亨廷顿病患者huntington基因的重复CAG序列可产生一段多聚谷氨酰胺链（polyglutamine，polyQ），连于HTT的末端，使HTT与其他蛋白结合形成不溶性复合物（核内包涵体形成），并与其他蛋白相互作用，使神经元内蛋白错误折叠，影响蛋白的进展和降解过程，产生毒性功能。

将提取自亨廷顿病人的成纤维细胞（huntingtin基因内CAG重复序列达143）通过脑立体定位注射的方法注射到恒河猴脑室内（成年模型动物注射到第三脑室，新生模型动物注射到侧脑室），从而建立亨廷顿病的恒河猴模型。成年模型动物选择雄性、年龄4-8周岁、体重6-8公斤的恒河猴。新生模型动物选择出生1-4天、体重400-600克的恒河猴。每只动物注射100μl，1×107个细胞。

取物试验（Object retrieval task）

在脑立体定位注射人成纤维细胞手术后，通过取物试验检测成年模型组和对照组动物的运动和认知功能水平。结果如图3所示，与对照组相比，（A）注射HD患者成纤维细胞后，成年模型组动物在取物训练过程中出现的运动错误数量无明显差异，（B）成年模型组动物取物训练过程中出现的认知错误无明显差异，（C）各组动物一次尝试即正确完成的成功率无明显差异。结果反映，成年模型组与对照组在上肢运动和认知功能上无明显差异。

1 实验材料

（1）药品与试剂：

标准物质多巴胺（DA）、乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）来自Sigma Aldrich公司（圣路易斯，美国莫州）。 （2）仪器： ① 行为学检测：水迷宫仪器 ② 机制检测：全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）、超声细胞破碎仪（美国Sonics公司）、分析天平（梅特勒托利多公司）。2 评价方法 （1） 行为学评价: ① 大鼠水迷宫实验 水迷宫实验（Morris Water Maze test, MWM test）采用大鼠水迷宫计算机图像实时检测分析处理系统进行。大鼠水迷宫为直径180cm，高60cm 圆形的水池。在水池壁上标明4 个点，并据此将水池分为四个象限，于其中一象限中心置一直径为10cm，高30cm 的铁质圆形平台，水面高于平台1cm，水温控制在(25±2)℃。水迷宫测试分为两个阶段，即①定位航行实验，历时5 天，每只动物每天3 个象限（实台象限除外），将大鼠面向池壁放入水中，记录1.5 min 内寻找平台所需时间(寻台潜伏期)。若大鼠入水后1.5 min 内未能找到平台，则将其置于平台上并停留30s，寻台潜伏期记录为1.5 min。② 空间探索实验，定位航行实验结束后撤除平台，将大鼠面向水壁从对角象限入水放入池内，记录1.5 min 内，动物在实台象限的游程、时间等指标。

② 小鼠避暗实验

避暗实验前一天，将动物头部背向电动门自明室放入，任其在明暗室内自由活动以熟悉环境。5 min 后，取出，放回原笼。实验分为记忆获得和巩固两个阶段，均于给药1 小时后开始检测。记忆获得阶段：将动物头部背向电动门自暗室放入，暗室电压幅度为39v。检测时间为5 min。软件自动记录5 min内错误次数、暗室时间及暗室路程。24 小时后，进行记忆巩固实验：将动物头部背向电动门自明室放入，即开始实验，电压幅度为39 v。软件自动记录5 min 内错误次数、入暗潜伏期、暗室时间及暗室路程。

③皮毛状态测试

皮毛状态测试在实验前及应激刺激结束后各测试一次。皮毛状态测试部位包括头、颈、背部、腹部、前后爪、尾巴、生殖器七个部位。皮毛整洁，计0分，皮毛脏乱，计1分。皮毛状态指数=计分总数/部位数。

（2）机制的检测

①CUMS对大鼠神经递质检测

采用实验室前期的实验方法-LC-MS/MS进行测定。

色谱条件：色谱柱为 TSK-GEL Amide-80，柱温35 ℃；以乙腈–水 (含6 mM HCOONH4)（67.5 : 32.5）为流动相，0.2 mL/min 流速。

质谱条件：ESI 离子源；正离子模式检测；电喷雾电压为4500V；信号采集方式为多反应检测（MRM）；GS1：50 psi；GS2：50 psi；TEM：450℃。

标准溶液的配制：精密称取标准品 DA， NE，5-HT，Ach，GABA，Glu，DHBA 各 1 mg，用含0.2% 甲酸的甲醇：水(1：1)配制成 1 mg/mL 的储备液（-80℃保存），临用前分别吸取各神经递质的标准储备液20 μL，加入860 μL 含 0.2% 甲酸的甲醇水（1:1），配制成20 μg/mL 的混合标准液，涡旋混匀，然后分别稀释至1000，500，200，100，50，20，10，5，2，1，0.5，0.2，0.1 ng/mL 的系列混合标准液，稀释后每200 μL混合标准液中加入300 μg/ml 的内标溶液20 μL。标准溶液均在临用前配制。

测定方法：组织称重，向EP 管中加入200 μl 纯水。用超声破碎仪进行匀浆，后加入400 μL含0.2%甲酸乙腈，放于-20℃冰箱内过夜。次日从冰箱内取出样品，在4℃离心12000r/min，10min，各取上清液200 μL，加内标20μL(300μg/mL DHBA)，将样品50μl 注入LC-MS/MS 进行分析。

②CUMS对小鼠神经递质检测

方法同大鼠。

（3）统计分析

实验结果采用SPSS 22. 0 统计软件进行统计学分析，结果以均值±标准误（Mean ± SEM）形式表示。采用one-way ANOVA 进行组内比较，使用最小显著差数法（LSD）多重比较方法比较两组间差异，当P <0.05则认为差异具有统计学意义。

3. 结果

（1）CUMS对大鼠的影响

① CUMS对大鼠体重的影响

CUMS 模型组大鼠在应激发生第2、3、4、5 周后体重较正常组明显下降（P<0.01）。西酞普兰组未能逆转应激因素导致的体重下降。

② CUMS对大鼠水迷宫的影响

前5天的定位航行中，CUMS大鼠从第二天起寻台潜伏期比正常大鼠长（P<0.05）。在第六天的空间探索实验中CUMS大鼠与正常大鼠相比，跨平台位置次数明显减少（P<0.05）。

（2）CUMS对小鼠的影响

①CUMS对小鼠体重的影响

随着应激时间的延长，CUMS模型组体重增加缓慢，第5周时，模型组体重明显下降，与正常组相比，具有显著性差异。

③ CUMS对小鼠避暗实验的影响

结果显示，避暗实验记忆巩固阶段，CUMS模型小鼠入暗次数及在暗室中的时间和路程均明显增加，与正常组相比，具有显著性差异（P<0.01）。图3 CUMS模型对小鼠避暗实验的影响（mean±SEM ，n=12，**p<0.01，与正常组比较） （3）机制检测结果 ① CUMS对大鼠前额皮层组织神经递质的影响

CUMS 模型组前额皮层5-HT含量较正常组明显下降（P<0.01），模型组前额皮层NE含量较正常组明显下降（P<0.05）

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。