一、疾病概述

慢性心力衰竭（Chronic heart failure, CHF）是由于心脏结构或功能异常导致 心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征, 是多种心脏病终末阶段的临床表现。慢性心衰患者的再 入院死亡率每年约为 20%，五年死亡率接近 50% 。因此，在机体出现心衰之前早期防治应该是治疗研究的重点，阻止心肌损伤和重构，是降低心衰发生发展的关键。

本研究设计基于同源重组理论，利用胚胎干细胞打靶及显微注射技术，构建了Drd5floxp/flox小鼠，利用Cre/LoxP系统复制Drd5在心肌细胞可诱导性条件敲除小鼠(Drd5flox/flox, Myh6 CreERT2)，在成年后特异性心脏敲除Drd5，得到可稳定遗传、既有明显表型又保持原有生存率的心肌病模型.该小鼠给予他莫昔芬诱导后两周表现为左心室肥厚，6周后射血分数和短轴缩短率持续降低，心腔扩大，室壁变薄，心肌纤维增多，心功能严重受损。

二、模型背景

1、造模因素信息

可诱导型心脏Drd5基因条件性敲除小鼠模型

2、实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

我们实验室已经报道 Drd5基因敲除小鼠，出现心肌肥大、心脏重量增加[1]。心脏特异性转人Drd5突变基因小鼠（hD5RF173L基因，D5R功能障碍），3月

龄出现心肌肥大、心功能损伤，心肌氧化应激水平显着增加[2]。研究结果表明，D5R功能障碍与心肌肥大、心脏损伤密切相关。

我们设计构建可诱导型心脏特异性Drd5基因敲除小鼠（Drd5flox/flox,Myh6 CreERT2），腹腔注射他莫昔芬，特异性敲除心脏D5R的表达，其他组织中D5R表达正常，更能精准降低心脏D5R，从而构建心肌肥厚导致心衰模型。该模型小鼠3月龄时给予他莫昔芬诱导，诱导心脏D5R基因敲除2周后，出现左室前壁肥厚，基因敲除6周后心功能显著下降。该模型对于研究心肌肥厚导致的心衰疾病的病理生理过程具有临床意义。

参考文献：

[1]Z. Yang, L.D. Asico,P. Yu, Z. Wang, J.E. Jones, C.S. Escano, X. Wang, M.T. Quinn, D.R.Sibley, G.G. Romero,R.A. Felder, P.A. Jose. D5 dopamine receptor regulation of reactive oxygen

species production,NADPH oxidase, and blood pressure. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2006, 290(1):R96-R104.

[2] Xiaoliang Jiang, YunpengLiu, Xing Liu et.al Over-expression of a cardiac-specific human dopamine D5 receptormutation in mice causes a dilated cardiomyopathy through ROS

over-generation by NADPHoxidase activation and Nrf2 degradation. Redox Biol,2018,19(10):134–146.

一、模型设计原理：

GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现Drd5基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。

根据Drd5基因组结构和蛋白功能保守区分析可知：Exon2（aa1-478）为公共外显子，位于蛋白功能保守区上：7tm_GPCRssuperfamily domain，条件性删除这个外显子后，将破坏7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此决定在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。

Drd5基因存在1种转录产物，见下图：

http://uswest.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000026496;r=1:180568924-180601254

1）GRNA靶点设计及活性检测

在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下

使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下：

gRNA靶点活性检测结果

靶点活性数据分析如下：

根据活性检测结果，我们选用活性最高的L2,R1进行F0代首建鼠构建。

2）PCR结果分析

M-CKO-M30 (1-19,NC)目的带扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：

M：BM2000 Marker，如右图所示

NC:阴性对照

如图所示，5♂扩出目的条带

3）Drd5floxp/flox小鼠测序结果分析

以M-CKO-M30-5小鼠测序结果为例，测序结果标注如下：

5’端FloxP比对结果：

3’端FloxP比对结果：

5♂xC57♀（1-9♂；10-18♀）用引物F2/R2扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：

WT：野生型对照 NC:阴性对照，如图所示，2#,4-6#,8#,11#,16#扩出双带

5♂xC57♀（1-9♂；10-18♀）用引物F/R扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：

4）Drd5floxp/flox小鼠测序结果分析

将2#，4-6#，8#，11#和16#由引物F/R做PCR得到的产物送测序，测序结果分析2#，4-6#，8#，11#和16#小鼠均为两端准确插入floxp序列的杂合子。

5）Drd5心肌细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠的繁育及鉴定结果：

Drd5floxp/flox小鼠与Cre的小鼠（Myh6 CreERT2）杂交，对后代自交获得的小鼠进行基因型鉴定，成功获得Drd5心肌细胞诱导性条件性基因敲除小鼠Drd5myh6-creERT2）。见下图

M:Marker;3,4,5,6,8,9,10,11:Drd5flox/flox,Myh6CreERT2;1,2,5,7:Drd5 flox/flox

Drd5flox/flox,Myh6CreERT2小鼠结果分析：

1、生理生化分析：

图1.生化指标显示Drd5flox/flox,Myh6 CreERT2小鼠肌酸激酶（CK）较WT组显著升高，提示心功能受损，但是肝功能和肾功能marker未见显著差异。

2、大体及心脏超声结果：

图2.他莫昔芬诱导心肌Drd5基因敲除后，如图所示心脏体积逐渐扩大。超声结果显示，敲除两周后心室壁变厚，心腔容积变小，表现为心室肥厚；敲除6周后，心室壁变薄，心腔容积变大，射血分数与短轴缩短率均大幅下降，心功能严重受损。

3. 纤维化结果：

图3.Drd5flox/flox,Myh6CreERT2小鼠经过他莫昔芬诱导后，心脏Masson染色显示心肌细胞纤维化明显， western blot显示纤维化marker MMP2随敲除时间逐渐增加。免疫荧光显示KO小鼠心肌凋亡marker表达显著增加。

动物模型制备过程中，由由基因工程人员设计gRNA靶点及活性检测，Drd5flox/flox小鼠与条件性敲除小鼠的繁育和鉴定均由具有实验动物上岗证的专人完成，饲养人员进行日常饲喂，由兽医进行监督管理，造模期间动物状态良好，病死只数0，未使用微生物，对环境没有影响，造模方法可遗传。

该模型的创新型和应用价值：

D5R在肾脏表达丰富，全身敲除Drd5基因主要影响小鼠肾脏钠水代谢，因此通过心脏特异性敲除Drd5才能精准研究心肌D5R的作用。我们前期通过心脏特异性转人D5R缺失基因小鼠寿命不超过6月龄，且心衰作为慢性病，临床上通常发生在成年以后。因此，我们创新设计制作可诱导型心脏特异 Drd5 基因敲除小鼠，即在小鼠成年后，腹腔注射他莫昔芬，特异性敲除心脏D5R的表达，其他组织中D5R表达正常，对于肝肾等其他组织功能无影响，更能精准模拟心肌肥厚导致心衰的表型，同时更好地而研究人类疾病及相关机制和并进行评价药效。