一、疾病概述

手足口病( hand, foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。手足口病于1957年在新西兰被发现并以其临床症状而命名，在世界范围内均有流行。在我国2008年开始暴发流行，当年累计病例489540例，死亡127例；其后发病病例呈逐年上升趋势， 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面，手足口病高发于5岁以下婴幼儿，其中以1~3岁发病率最高，各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性，人口密度越大发病率越高。在时间方面，手足口病爆发存在明显季节性特征，尽管全年均有手足口病感染情况，但主要高发于夏季， 4~6月达发病高峰。在地区方面，中国南方一年中存在五月和十月两个发病高峰；而在北方仅有六月一个发病高峰，随着纬度的增加，其半年周期性可能会增强。与此同时，气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日，手足口病已被我国列为丙类传染病，该病流行已成为严重的公共卫生问题，为我国带来了巨大的经济和健康负担。

引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属（Enterovirus genus），基本结构为无包膜的二十面体，其直径为20-30nm，由核酸和蛋白质组成，是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框，开放阅读框编码多聚蛋白；其中VP1基因序列具有高度多样性，且较为稳定，因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。

EV71作为手足口病的主要病原，于1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。最近几十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发，主要集中于亚太地区。我国自2008年开始发生手足口病流行以来，EV71一直是主要的流行病原，且该病毒感染伴随严重的并发症几率相对较高，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭；因此一直是手足口病研究的重点。

二、研究背景

1、EV71病毒信息

EV71型是手足口病的主要病原体，临床可表现为手足口等部位出现疱疹及斑丘疹，重症可导致无菌性脑炎、神经源性肺水肿等神经系统病症与并发症，具有较高死亡率。1998年，在深圳首次于人体中分离出EV71病毒；2008至2011年，手足口病中EV71感染重症率高达80%以上，近年来略有下降但其重症率仍为60%左右。因此，EV71是手足口病中重要的嗜神经病毒，可引发中枢神经系统损伤，具有较高的致残率与致死率。

EV71是一个正向单链的RNA病毒，属于小RNA家族的肠道病毒属肠道病毒A种。大约包含7.4kb个核苷酸，基因组的顺序依次为5'端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3'端非编码区。两端为保守的非编码区，其中5’-UTR通常为折叠成多个特异性的空间结构，而这些结构通过与宿主细胞的蛋白因子结合，使得在其实病毒基因组中RNA的合成以及病毒蛋白的翻译过程中发挥了重要作用。P1 区编码4 种衣壳蛋白VP1 ~VP4，VP1 ~ VP3 在病毒表面，VP4 包裹在感染病毒的内部，这4种衣壳蛋白均具有抗原活性；P2 和P3 区编码7 种非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C 和3D，与病毒RNA 的复制、转录，病毒多聚蛋白的剪切、病毒颗粒的装配等功能相关。

基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及c1、c2、C3和C4亚型。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型，提示该C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。

EV71病毒可在RD细胞中培养，培养温度为 37℃，48~96h达到复制高峰，病毒滴度可达107TICD50以上；病毒在宿主细胞浆内增殖，迅速引起细胞病变（CPE），表现为细胞皱缩、变圆脱落，最后病毒颗粒破膜释放。EV71病毒的感染可以诱导机体产生高滴度的抗体，具有中和作用，能够抵抗病毒的再次感染。目前我国上市的EV71灭活疫苗，应用毒株为本国优势株EV71 C4基因型，对手足口病的保护率高达90%，也可预防EV71感染引发的重症手足口病，保护率达80%。

2、实验动物背景信息

STAT1基因敲除小鼠（STAT1-/-）的背景品系为C57BL/6，毛色黑色，具有C57BL/6品系小鼠的生物学特征。C57BL/6主要特征包括：乳腺癌发病率低，对放射物质耐受力中等；补体活性高；细胞免疫力随月龄增加减少降低，较易诱发免疫耐受性；对鼠痘病毒有一定抵抗力；干扰素产量高；嗜酒精性高，肾上腺素类脂类脂质浓度低；对百日咳组织胺易感因子敏感。C57BL/6作为“标准”的近交系，为许多突变基因提供遗传背景，具有实验结果精度高、可比性号、应激反应均一的特点。10日龄STAT1基因敲除小鼠对EV71感染敏感，由于EV71对小鼠肌组织具有嗜性，乳鼠感染后表现出竖毛、单肢瘫痪、双肢瘫痪、甚至死亡的临床表现，属于手足口病部分疾病模型动物。

3、研究背景

JAK/STAT 信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路。STAT1 作为STAT 家族发现的第一个成员，是 JAK/STAT 信号通路中的关键转录因子，具有免疫调节、抑制细胞生长和促进细胞凋亡等功能，在细胞的增殖、凋亡中发挥重要的作用。

STAT1也是机体免疫系统实现抗病毒、减少组织损伤的的媒介之一，在许多抗病毒感染进程中扮演重要角色。STAT1介导的JAK/STAT 信号通路在EV71病毒感染过程中可以发挥抗病毒的作用，同时EV71病毒也可以影响STAT1信号通路的激活。对EV71病毒感染细胞进程中STAT1的影响进行研究发现，THP-1细胞的在EV71感染后STAT1磷酸化水平增加，使JAK/STAT 信号通路激活；横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）细胞STAT1介导的信号通路在EV71感染后，会通过干扰素途径使其激活。目前对EV71感染进程中STAT1的作用研究多处于细胞水平，利用STAT1基因敲除的小鼠模型进行动物整体水平的研究鲜有报道。台湾国防医学院报道了对7日龄的STAT1敲除小鼠进行了EV71病毒感染，采用腹腔注射感染108pfu/mouse的EV71临床分离株F23；感染动物可观察到肢体瘫痪(30%)，在脑干和脊髓中可观察到炎症，并检测到病毒VP1抗原的强表达，而在肢体肌肉中则未发现。从而说明EV71临床分离株F23在STAT1敲除小鼠模型中具有高度的嗜神经性而不是嗜肌肉性，肢体瘫痪主要是由神经系统疾病引起的（Immunodeficient Mouse Models with Different Disease Profiles by In Vivo Infection with the Same Clinical Isolate of Enterovirus 71.J Virol. 2014 ; 88(21): 12485–12499.）。本研究利用STAT1敲除的C57BL/6小鼠模型，在整体动物水平探讨STAT1基因对EV71病毒复制的影响，为减少病毒复制及控制感染症状等治疗提供可靠的数据基础。

1.STAT1基因敲除小鼠的鉴定：

STAT1基因敲除小鼠（STAT-/-C57BL/6）由医学实验动物研究所遗传中心研制，通过PCR鉴定基因敲除小鼠是否为纯合子。

（1）基因组DNA提取：

利用全式金DNA提取试剂盒提取小鼠基因组DNA。

（2）检测引物：

STAT1-KO-S5’ GAGAGTAATTTAATGGTTGGGCTCTM= 63

STAT1-KO-A5’ CATGTGAGTCCTGTATCCCTCTAATAGTAACTM=62

（3）PCR反应：TaKaRa LA Taq® Hot Start Version（Code No.RR042），反应条件：95℃ 15min；95℃30 s，64℃30 s，72℃1 min，72℃10 s，循环数为30；

（4）琼脂糖凝胶电泳结果：

图1：STAT1基因敲除小鼠纯合子和杂合子鉴定电泳图

WT:1080bp；纯合子STAT1-/-：540bp；杂合子STAT1+/-：1080bp + 540bp

2. 病毒准备：EV71病毒为FY0805毒株经小鼠传代所获得的适应株MP10（GenBank accession number:HQ712020）。

组织病毒培养操作：

将EV71病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

3. 实验动物：采用SPF级10日龄野生型C57BL/6小鼠、纯合子STAT-/- C57BL/6小鼠和杂合子STAT+/- C57BL/6小鼠，母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。EV71动物模型建立实验通过IACUC审核，符合动物实验要求。

4. 病毒感染：根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为1. 0×108TCID50/mL的EV71病毒，将病毒腹腔注射感染小鼠，感染剂量为100μl。

1.临床症状表型：

EV71感染后，与野生型C57BL/6小鼠组（WT）、杂合子STAT1+/-组相比，纯合子STAT1-/-组小鼠表现出更严重的临床症状、更高的死亡率以及更高的病毒载量。结果见图2。

图2.EV71感染对STAT1-/- C57BL/6小鼠病理生理状况以及血清病毒载量的影响

注：A：小鼠生存率统计；B：小鼠症状观察评分统计，无症状0分，竖毛1分，后肢行动迟缓2分，单侧后肢瘫痪3分，全部后肢瘫痪4分，死亡5分，分数不累加只记录最高分；C：小鼠体重变化统计；D：小鼠肌肉病毒载量检测。

结果表明，EV71感染后，WT小鼠在感染后6天（6dpi）出现死亡，而STAT1-/-小鼠在4dpi出现死亡情况，死亡时间提前。6dpiSTAT1-/-小鼠全部死亡，生存率为零，与其他组小鼠相比有明显差异（图2A）。对感染EV71后小鼠出现的症状表现进行评分并统计发现，STAT1-/-小鼠在3dpi症状急剧恶化，与其他组相比症状表现更为严重（图2B）。伴随症状加重，STAT1-/-小鼠在3dpi的体重明显减轻，其他两组小鼠体重仍逐渐增加（图2C）。

2.血液和组织中病毒复制情况：

感染3天后，对不同小鼠的后肢肌肉进行病毒载量检测，结果显示：3组动物肌肉的病毒载量都达到了108copies/mg；而STAT1-/-小鼠的肌肉病毒载量明显高于WT组与STAT1+/-组，在统计学意义上具有显著性差异（P＜0.01）（图2D）。说明EV71病毒在肌肉组织中大量复制扩增。

3. 病理变化情况：

利用HE染色对小鼠后肢肌肉的病理变化进行观察，利用免疫荧光技术对不同组小鼠后肢肌肉中EV71抗原的表达量进行了对比。结果见图3。

图3. EV71感染对STAT1-/-C57BL/6小鼠炎症损伤及病毒复制的影响

注：A：小鼠肌肉组织HE染色；B：小鼠肌肉组织EV71单克隆抗体免疫荧光染色。

对EV71抗原荧光染色结果显示，EV71抗原在小鼠后肢肌肉中有聚集现象，与WT组相比，这种现象在STAT1-/-小鼠中更加明显（图3B），据此推测EV71在STAT-/-小鼠后肢肌肉中复制水平增高。与WT组及STAT1+/-组相比，STAT1-/-小鼠表现出大片炎性细胞浸润与组织纤维化（图3A），组织损伤情况更为严重。

从生存率、病毒载量、HE染色等检测指标可见，STAT1基因敲除小鼠抵抗EV71病毒感染复制的能力存在严重缺陷，可能是导致EV71病毒感染加重的原因。

模型评价方法：

1. 临床症状观察：

在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。动物感染EV71病毒后观察9天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准低动物进行临床评分打分：0：未见异常；1：驼背或炸毛；2：后肢迟缓无力；3：单后肢瘫痪；4：双后肢瘫痪；5：死亡。

2. EV71病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

2.1取样：分别在感染后第3天、第5天处死动物，采集血液100ul和后肢肌肉组织样本50mg，感染第5天采集心、肝、脾、肺、肾、小肠、胸腺、脑组织，放入Trizol中；

2.2 RNA提取：采用Trizol法提取血液和组织中的RNA；

2.3 反转录：Thermo fisher公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit；根据说明书采用Radom Hexamer Primer，反应条件为：25℃ 5min；42℃ 60min，70℃ 5min；

2.4 SYBR Green染料法-荧光定量PCR检测病毒核酸浓度：

（1）特异性引物：

EV71-S1 (5’-AGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3’)；

EV71-A1 (5’-TAGCATTTGATGATGCTCCAATTTCAG-3’)

（2）标准品：建立质粒标准品，使用分光光度计检测质粒浓度，适当稀释使质粒浓度拷贝数为109，10倍稀释为8个梯度，每个浓度做3个重复，依据拷贝数与Ct值建立标准曲线。

（3）阴性对照和阳性对照：阴性对照用水代替核酸样本；阳性对照采用EV71病毒储液提取得到的核酸；

（4）荧光定量PCR试剂：Takara，SYBR Green Premix(with ROX)，根据试剂盒要求准备反应体系；

（5）反应条件： 94℃ 3min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，该步骤循环数为40；熔解曲线：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s。

（6）实验仪器：ABI Q3荧光定量PCR仪

（7）结果分析：①反反应结果应符合阴性对照无扩增的条件，否则实验结果无效。②标准曲线：标准曲线R2大于0.95可用，若低于0.95数据不可用，则需重新测定；③结果判断：根据标准曲线计算出EV71病毒的载量。病毒载量的检测阈值为2X102copies/μl，低于该数值的结果不可信。

3.病理分析：

（1）HE染色

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

小鼠感染EV71病毒3天后，取后肢骨骼肌置于10%福尔马林中固定72 h，经梯度酒精脱水后将其包埋在石蜡中，切片得到的石蜡切片厚度为 5 μm，随后进行H&E染色，最后在光学显微镜下观察组织病理变化。

（2）免疫荧光分析

免疫荧光染色利用抗EV71单克隆抗体（1：500）作为一抗，4℃过夜，随后0.01M PBS清洗3次，鼠抗兔IgG（H+L）作为二抗（1:200）孵育1h，0.01M PBS清洗后附荧光抗体，在激光共聚焦显微镜下观察。

（二）评价指标：

1.临床症状评价：根据临床评分标准，在观察期（9天）内，WT和STAT1基因敲除动物在第4天都可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；纯合子STAT1-/-第4天即出现死亡，WT动物在第6天才出现死亡，而此时STAT1-/-已全部死亡；最终观察期结束时WT的存活率为40%，而杂合子STAT1+/-存活率为30%。

2.组织中病毒复制情况评价体系：动物在腹腔感染EV71病毒后第3天WT和STAT1基因敲除小鼠肌肉中病毒载量均值都超过108copies/mg，说明病毒在肌肉中都大量扩增；且纯合子STAT1-/-病毒载量最高，与其临床症状表现和存活率的结果相吻合。

3. 病理评价体系：EV71病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润；而纯合子STAT1-/-的炎症严重程度最强，杂合子STAT1+/-次之。进一步的组织免疫荧光分析同样发现纯合子STAT1-/-中EV71 VP1的分布最多。病理结果、免疫荧光结果跟病毒载量、临床症状表现相一致。

EV71病毒在人间传染病名录中属于第三类，涉及的实验需在BSL-2实验室进行，动物实验在ABSL-2实验室开展。EV71病毒已经过风险评估，具有相应标准操作程序。

EV71病毒对5岁以下儿童易感，主要通过粪口传播，对于具有BSL-2防护装备的实验人员危害较小；实验人员均经过生物安全培训获得证书；进入动物房之前，穿戴防护服、口罩、帽子、鞋套，防护眼镜等进行防护；实验结束后按要求去除防护设备集中处理。

成年C57BL/6小鼠对EV71病毒不敏感，成年小鼠在感染大剂量病毒后仍能自愈。对于感染动物的排泄物进行检测，在少数粪便样本中检测到少量病毒；因此需对垫料等接触动物粪便的物品按要求进行高压灭菌处理。

动物感染病毒后取得的血液和组织直接放入核酸裂解液或组织固定液，灭活病毒。所有涉及到的相关污染物如离心管、灌胃针、手术剪、手术镊和毒株等将统一高温高压消毒后集中处理。实验后将病毒毒株、动物尸体、尿垫等包装好进行高压灭菌处理，注射器放入利器桶处理。

通过本实验证实，STAT1基因敲除可以导致小鼠对EV71的敏感性增高。EV71病毒感染STAT1基因敲除小鼠后，其生存率、体重水平明显降低，症状严重程度及病毒载量显著增高，肌肉病理损伤更加严重，免疫荧光染色结果也可以观察到EV71抗原在STAT1-/-小鼠肌肉的聚集水平升高。

台湾国防医学院建立的EV71病毒感染STAT1敲除小鼠模型，采用7日龄STAT1敲除小鼠，腹腔注射感染108pfu/mouse的EV71临床分离株F23。本课题组建立的模型与之虽都采用了STAT1基因敲除的小鼠感染EV71病毒，但是存在以下不同：①病毒毒株的基因型不同，本模型采用FY0805病毒株，属于C4亚型；而台湾采用的F23属于B5亚型。②虽然两种模型都能观察到感染动物发生了肢体瘫痪，但是在台湾模型中只在脑干和脊髓中观察到炎症，并检测到病毒VP1抗原的强表达，但在肢体肌肉中则未发现；而本模型从感染3天后的后肢肌肉中检测到了大量的EV71病毒。③台湾模型说明EV71临床分离株F23在STAT1敲除小鼠模型中具有高度的嗜神经性而不是嗜肌肉性，肢体瘫痪主要是由神经系统疾病引起的；而本模型通过肌肉中的高病毒载量、病理炎症反应和免疫荧光EV71 VP1的高表达，说明EV71病毒FY0805病毒株具有高度的嗜肌性。

STAT1在细胞因子调节网络中扮演重要的角色，STAT-/-小鼠模型的构建，对研究机体免疫功能提供了强有力的研究工具。现已证实STAT1基因的缺失导致小鼠对EV71的敏感性增高。本实验从动物整体水平上探索了STAT1在抗EV71感染中的作用，可以为今后减少病毒复制及控制感染症状等治疗提供可靠的数据基础。